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| 核仁素的蛋白质-RNA杂交体系诱饵载体的构建及表达 |
| 蒋碧梅;何淑雅;苏娇;王桂良;王海云;肖献忠 |
| 中南大学湘雅医学院病理生理教研室,湖南,长沙,410008;南华大学生物化学与分子生物学教研室,湖南,衡阳,421001 |
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| Construction and Expression of "Bait Plasmid" of Nucleolin in RNA-Protein Hybrid HunterTM System |
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摘要 [目的]将核仁素开放阅读框构建到Hybrid Hunter蛋白质-RNA杂交系统pYESTrp3"饵"载体,明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,验证其能否用于蛋白质-RNA杂交体系筛选cDNA文库.[方法]设计引物,从真核表达载体pEGFP-N1-C23上,扩增出C23开放阅读框,经EcoR I和Not I双酶切后,克隆到蛋白质-RNA杂交的"饵"载体pYESTrp3质粒上,构建成载体pYESTrp3-C23.阳性克隆经EcoRI和Not I双酶切鉴定后,转入酵母中,用酵母蛋白抽提物作Western杂交,证实其表达;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用.[结果]所构建的载体pYESTrp3-C23双酶切后,片段大小正确;转入酵母菌L40-ura3/pHybLex/Zeo-MS2后,提取酵母质粒,PCR扩增出预期大小的片段,Western杂交出现阳性条带;滤膜杂交,转有pYESTrp3-C23和阴性对照pYESTrp3的酵母菌落没有激活报告基因,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色.[结论]含有C23的"饵"载体构建正确,在酵母细胞中能表达出C23蛋白,并且没有自身激活报告基因的功能,能够应用于蛋白质-RNA杂交体系.
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| 关键词 ：
遗传载体,
蛋白质类
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收稿日期: 2007-03-20
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| 基金资助:国家自然科学基金(30330280)%国家自然科学基金(30300177;30470851) |
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